با عنوان : اظهار وتخلیص پروتئين نوترکيب DR2418 داينوکوکوس راديودورانس

در ادامه مطلب می توانید تکه هایی از ابتدای این پایان نامه را بخوانید

و در صورت نیاز به متن کامل آن می توانید از لینک پرداخت و دانلود آنی برای خرید این پایان نامه اقدام نمائید.

دانشگاه آزاداسلامی

واحد دامغان

دانشکده علوم پایه

 پایانامه کارشناسی ارشد رشته میکروبیولوژی

عنوان پژوهش:

اظهار وتخلیص پروتئين نوترکيب DR2418 داينوکوکوس راديودورانس در اشريشيا کلي

استاد راهنما:

آقای دکتر جلیل فلاح مهر آبادي

استاد مشاور:

آقای دکتر مجید مقبلی

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده درج نمی گردد

تکه هایی از متن به عنوان نمونه : (ممکن می باشد هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود اما در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل می باشد)

فهرست

عنوان               صفحه

فصل اول : مقدمه و کلیات.. 2

فصل دوم : مروری بر تحقیقات انجام شده. 7

2-1-   ترمیم شکستگیهای DNA دورشتهای: 11

2-2-   مکانیسم ترمیم شکستگی DNA دورشته ای: 12

2-2-2-   اتصال تک رشته (SSA): 13

2-2-3-   سنتز Extended وابسته به اتصال رشته ها (ESDSA): 13

2-3-   ساختار نوکلئوتید. 14

2-4-   پاسخ سلول های داینوکوکوس متعاقب اشعه گاما: 15

2-5-   ژن های دخیل در مقاومت بخشی به اشعه: 16

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را در شماره بندی انتهای صفحه بخوانید              

2-6-   منابع میکروبی مقاوم به پرتو فرابنفش و پیامدهای درمانی: 18

2-7-   فواید اکستریموفیلهای مقاوم در برابر تابش… 20

2-7-1-   پیامدهای دارویی اکستریمولیت های مقاوم در برابر تابش… 21

2-7-2-   پیامدهای بیوتکنولوژیکی اکستریمولیت های مقاوم در برابر اشعه 27

2-8-   محدودیتها و چالشها در دیدگاه پنج ساله 30

فصل سوم : مواد و روشها 33

3-1-   آماده سازي وکتور pGEM-B1 حاوي ژن سنتتيکdr2418-opti 35

3-2-   مستعدسازي E.coli DH5a. 35

3-3-   تراريختي يا انتقال وکتور حاوي ژن سنتتيک به درون سلول مستعد E.coli DH5a. 36

3-3-1-   استخراج پلاسميد pGEM-B1 حاوي ژن سنتتيک dr2418-opti 37

3-3-2-   تاييد استخراج پلاسميد حاوي ژن سنتتيک با روش آگارز ژل الکتروفورز 38

3-3-3-   آماده سازي نمونهها براي الکتروفورز 38

3-3-4-   رنگ آميزي DNA در ژل آگارز 39

3-3-5-   تهيه بافر TBE(10X) 39

3-3-6-   طرز تهيه ژل آگارز 39

3-3-7-   هضم آنزيمي وکتور pGEM/dr2418 توسط آنزيم NdeI 40

3-3-8-   هضم آنزيمي وکتور pGEM/dr2418 توسط آنزيم BamHI 41

3-3-9-   تخليص ژن سنتتيک dr2418 از روي ژل. 41

3-3-10-   برش پلاسميد pET-21a توسط آنزيم NdeI 43

3-3-11-   برش وکتور pET-21a (هضم شده با NdeI) توسط BamHI 43

3-3-12-   ليگاسيون وکتور pET-21a و ژن سنتتيک dr2418. 44

3-3-13-   ترنسفورماسيون pET/ dr2418 در سلول مستعد DH5a. 45

3-4-   توالييابي ژن سنتتيک در pET-21a. 45

3-5-   القاء ساختارهاي بياني pET21a-dr2418 توسط IPTG به مقصود توليد پروتئين DR2418 داراي برچسب هيستيدين (His-tagged r-dR2418): 46

3-6-   ارزيابي پروتئين DR2418 توليد شده به وسيله الكتروفورز در ژل پلي آكريلاميد (SDS-PAGE) 47

3-7-   يكسان سازي غلظت كلي پروتئينها در نمونه هاي قبل و بعد از القا جهت انجام SDS-PAGE. 50

3-8-   شناسائي و تائيد پروتئين His-tagged r-DR2418 با روش Western blot 50

3-9-   نگهداري و ذخیره باكتريهاي مولد پروتئين ِDR2418: 52

3-10-   بررسي پايداري پلاسميدها (Plasmid stability Test) 53

3-11-   خالصسازي پروتئین نوترکیب DR2418 به روش کروماتوگرافی. 53

3-11-1-   ليز سلولي باکتری E.coli 54

3-11-2-   آماده كردن ستون. 54

3-11-3-   تزريق نمونه و شستشو. 55

3-11-4-   جدا سازی يپروتئین نوترکیب.. 55

3-11-4-1-   روش دياليز. 56

3-11-5-1- رسم منحنی استاندارد 56

3-11-5-2- تهیۀ محلول برادفورد 57

3-11-6-   بازيافت و نگهداري ستون. 57

 فصل چهارم : نتايج.. 58

4-1-   غربال كردن كلني هاي حاوي pGEM-B1 داراي قطعه DR2418: 59

4-2-   غربال كردن كلنيهاي E. coli DH5 حاوي pGEM-B1 داراي قطعه 59

4-2-1-   تایید پلاسمیدهای استخداج شده با برش آنزیمی NdeI: 60

4-2-2-   تایید پلاسمیدهای خطی شده حاوی ژن سنتتیک با هضم آنزیمی BamHI: 60

4-3-   جداسازی قطعه از روی ژل و فرایند Ligation: 61

4-3-1-   تایید صحت واکنش Ligation ژن در وکتور با روش تعیین توالی: 63

4-4-   ترانفسفورم وکتور pET21a حاوی ژن dr2418 به سلول E. coli Origami و ارزيابي بيان پروتئين DR2418: 64

4-5-   شناسائي و تائيد پروتئين DR2418 با روش Western Blot Wet transfer)) 64

4-6-   اظهار ژن dr2418 در حجم یک لیتر محیط کشت.. 66

4-7- برسی تخلیص پروتئین بر روی ژل SDS_PAGE: 67

4-8- نتایج سنجش غلظت پروتئین: 67

فصل پنجم : بحث و نتيجه گيري…………. 69

 ضمیمه: 76

 پیشنهادات: 84

شما می توانید مطالب مشابه این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید                     

 منابع. 85

 چكيده انگليسي.. 91

چکیده

زمینه و اهداف: داینوکوکوس رادیودورانس یکی از میکروارگانیسم های مقاوم به پرتو می باشد و می تواند در محیط های خشن به حیات خود ادامه دهد. مطالعات نشان می دهد که چندین پروتئین آنتی اکسیدان و ترمیم کننده DNA در مقاومت بخشی به پرتو تأثیر دارد. پروتئین DR2418 یکی از پروتئین های تنظیمی مهم در داینوکوکوس رادیودورانس در مقاومت بخشی به پرتو می باشد. هدف از این مطالعه کلونینگ و اظهار ژن dr2418 در E. coli و تخلیص پروتئین این ژن می باشد.

روش کار: ژن dr2418 داینوکوکوس رادیودورانس بصورت سنتتیک در وکتور pGEM-B1 ساخته گردید و به دنبال آن ژن dr2418 در وکتور بیانی pET21a ساب کلون گردید. صحت ساب کلونینگ توسط هضم آنزیمی و توالی یابی تایید گردید. ژن dr2418 در E. coli اظهار گردید و پروتئین نوترکیب DR2418 توسط ژل الکتروفورز پلی اکریل آمید و وسترن بلاتینگ تایید گردید.همچنین با بهره گیری از ستون کروماتوگرافی جذبی این پروتئین تخلیص گردید.

نتایج: پلاسمید pET21a حاوی ژن dr2418 به همراه برچسب هسیتیدینی در قسمت C-ترمینال بطور موفقیت آمیز ساخته گردید. هم چنین، پروتئین نوترکیب DR2418بصورت داخل سلولی در E. coli ترانسفورم شده تولید ، و تخلیص آن با موفقیت انجام گردید.

نتیجه گیری: نتایج این مطالعه نشان داد که پروتئین rDR2418 می تواند به عنوان یک کاندید مناسب پروتئین مقاوم به پرتو در نظر گرفته گردد. بااین حال، خاصیت مقاومت به پرتو پروتئین DR2418 بایستی در سیستم های پروکاریوتی و یوکاریوتی واکاوی گردد.

محيط­هاي داراي پرتوزايي جزء محيط­هاي خشن (Extreme) مي­باشند و در اين محيط­ها ميکروارگانيسم­هاي مقاوم به اشعه­هاي راديواکتيو در خانواده­هاي مختلف باکتريايي يافت مي­شوند. به عنوان مثال گونه­هاي جنس Deinococcus حتي در دوزهاي 25 KGy از خود مقاومت نشان مي­دهند که يکي از معروف­ترين گونه­هاي متعلق به جنس Deinococcus و مقاوم به اشعه، Deinococcus radiodurans مي­باشد، بطوريکه اين باکتري حتي در پرتوهاي با دوز بالا به حيات خود ادامه مي­دهد. اين باکتري جزء باکتري­هاي غير بيماريزا می باشد و مي­توان آن را از محيط­هاي طبيعي جداسازي نمود و در محيط­هاي کشت آزمايشگاهي آن را کشت داد. مطالعات مختلفي در مورد مکانيسم مقاومت Deinococcus radiodurans به اشعه راديواکتيو انجام شده می باشد و مطالعات نشان مي­دهد که ژن­هاي کدکننده پروتئين­هاي دخيل در ايجاد مقاومت به اشعه در اين باکتري هست ولي مکانيسم مولکولي آن هنوز بطور کامل مشخص نشده می باشد. با اين حال مطالعات اخير ژن­هاي مختلفي از قبيلDR2418، DR1709، pprI، RecX را گزارش کرده­اند که در ايجاد مقاومت به اشعه داراي تأثیر بسزايي مي­باشند و عملکرد آنها در زمينه از بين بردن راديکال­هاي سمي اکسيژن و ترميم DNA آسيب ديده مي­باشد.

محيط­هاي خشن (Extreme) يکي از محيط هاي پرچالش براي ارگانيسم هاي زنده می باشد. با اين حال، تعداد زيادي از ميکروارگانيسم­هاي متعلق به سه قلمرو حيات (باکتري­ها، يوکاريوت­ها و آرکي­ها) از محيط­هاي خشن مانند هيدروترمال و محيط­هاي خشک در معرض اشعه UV، محيط هاي بسيار گرم جداسازي شده اند. در ميان اين ارگانيسم­هاي مقاوم به شرايط خشن، باکتري­هاي متعلق به خانواده Deinococcaceae توانايي بسيار بالايي براي زيستن در محيط هاي در معرض اشعه هاي يونيزان دارند و Deinococcus radiodurans يکي از بهترين گونه هايي می باشد مورد مطالعه قرار گرفته می باشد.

اين باکتري توسط توانايي استثنايي اش در مقابله با اثرات تخريب کننده ساختار DNA مانند اشعه يونيزان، نور ماوراي بنفش و شرايط خشکي مورد شناسايي قرار گرفته می باشد.

اشعه­های یونیزان توسط تخریب عناصر رادیواکتیو تولید می گردد و منجر به تولید الکترون ها و یون های مختلف می گردد. اشعه های گاما فوتون هایی هستند که مولکول های سلولی را تغییر می دهند و رادیکال های هیدروکسیل بسیار فعال تولید می کنند (ROS) بخصوص OH. توسط یونیزاسیون مولکول های آب. این رادیکال های آزاد بطور مستقیم و غیرمستقیم باعث تخریب DNA می شوند و تغییرات بازی و شکست دورشته و تک رشته DNA را به وجودمی آورند. مطالعات نشان می دهد که 80% از تخریب DNA ناشی از عملکرد ROS می باشد و فقط 20% توسط برهم کنش مستقیم فوتون های گاما و DNA می باشد و تعداد شکست های DNA دو رشته ای نسبت مستقیم با اندازه ژنوم دارد (Gerard E , 2001). اولین مسیر حفاظت علیه استرس اکسیداتیو وجود آنزیم های آنتی اکسیدان همانند سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز می باشد که بیومولکول ها را از آسیب هاب ناشی از ROS محافظت می کند (شکل 1). سوپراکسید دیسموتاز تبدیل اکسیژن را به سوپراکسید اکسیژن کاتالیر می کند تا در نهایت پراکسید هیدروژن به H2O تبدیل گردد (شکل 1). مطالعات نشان می دهد که D. radiodurans در هنگام مواجه با اشعه یونیزان سه نوع سوپراکسید دیسموتاز و سه کاتالاز کد می کند. در آرکی ها، سوپراکسید دیسموتاز توسط ارگانیسم­های هوازی (نظیر Halobacterium) و چند ارگانیسم بی هوازی مانند Methanosarcina barkeri کد می گردد. در ارگانیسم های بی هوازی سوپراکسید ردوکتاز (SOR) کد می گردد (شکل 1). سوپراکسید ردوکتاز در هنگام اکسیده شدن نیاز دارد تا توسط روبردوکسین احیا گردد که خودش هم توسط آنزیم NAD(P)H روبردوکسین اکسی ردوکتاز (NROR) اکسیده می گردد. در نهایت پراکسید به H2O توسط عملکرد روبرترین تبدیل می گردد. به علاوه، بعضی از ارگانیسم های بی هوازی، از مسیرهای بدون تولید پراکسید هیدروژن، برای حذف سوپراکسید بهره گیری می کنند (تصویر C1). مطالعات کریستالوگرافی نشان می دهد که سوپراکسید ردوکتاز با فروسیانین کمپلکس تشکیل می دهد (Adam V , 2004). این کمپلکس بطور موثر با رادیکال های سمی اکسیژن واکنش می دهد و محصول نهایی واکنش پراکسید هیدروژن نیست
اما فورمات و H2O تولید می­گردد (شکل 1).

شکل 1. مسیرهای سمیت زدایی سوپراکسید اکسیژن در (A) هوازی ها و ارگانیسم های بی هوازی (B و C). Cyt bd: سیتوکروم bd یوبی کوئینول اکسیداز. Prx: پروکسی ردوکسین، rd: روبردوگسین، SOD: سوپراکسید

دیسموتاز، SOR: سوپراکسید ردوکتاز، NROR: NAD(P)H روبردوکسین اکسی ردوکتاز.

 در اين تحقيق در نظر می باشد پروتئين DR2418 به صورت نوترکيب تهيه تا در تحقيقات آتي از آن بهره گیری گردد.

به گونه اختصار اهدف این پژوهش به توضیح زیر می باشد:

_ با در نظر داشتن اینکه ژنهاي ایجادکننده مقاومت به اشعه در باکتري Deinococcus radiodurans هست، می توان عملکرد این ژنها را در مقیاس آزمایشگاهي بررسي نمود. پس هدف از این مطالعه، تهیة پروتئیني بود که در مقاومت باکتري نسبت به پرتو تأثیر دارد. در تحقیقات آتي میتوان از آن براي تهیة مواد ضدپرتو بهره گیری نمود.

_   کلون کردن ژن dr2418 در وکتور pGEM وساب کلون کردن آن در وکتور بیانی pET21

_     مطالعه میزان اظهار پروتئین DR2418 در میزبان E.coli origami

_   خالص­سازي پروتئین نوترکیب DR2418 به روش کروماتوگرافی

تعداد صفحه :109

قیمت : چهارده هزار و هفتصد تومان

***

—-

پشتیبانی سایت :        ———-        serderehi@gmail.com