ت که رنگ‌آمیزی باکوماسی بلو نیاز به محیط اسیدی برای جاذبه الکتروستایک دارد تا بین ملکول‌های رنگ در گروه‌های آمینو پروتئین‌ها اعمال کند. این جاذبه یونی باعث تشکیل رنگ پروتئین می‌شود. مطالعات در مورد مکانیسم عمل این رنگ نشان داده است که همبستگی معنی‌داری بین میزان رنگ و باقی مانده اسیدهای لیزین، هیستدین و آرژنین در پروتئین وجود دارد. حداقل زمانی که برای رنگ‌آمیزی لازم است بستگی به ضخامت ژل و غلظت ژل دارد، هر چه ضخامت ژل و غلظت ژل بیشتر باشد مدت زمان لازم افزایش می‌یابد (Hames وRickwood، ۱۹۸۱)‏.
شناسایی باند‌ها: پس از رنگ کردن و آشکار سازی پروتئین‌ها، باندهای حاصله را برحسب فاصله‌ای که از بالای ژل دارند و اصطلاحا تحرک نسبی خوانده می‌شود، شناسایی می‌کنند.
مسافتی که پروتئین در ژل زیرین حرکت کرده است تقسیم بر مسافتی که رنگ در ژل زیرین حرکت کرده
Dunn.1933

از آنجا که پروتئین‌ها به عنوان محصولات مستقیم ژن‌ها شناخته می‌شوند، انتظار می‌رود افرادی که از لحاظ ژنتیکی به یکدیگر نزدیک هستند، باندهای مشابهی را تولید کنند. برای بررسی شباهت‌های بین یک جمعیت با استفاده از این باندها از ضرایب زیر استفاده می‌شود:
تشابه اندیس از فرمول محاسبه میشود.
که در آن w تعداد باندهای مشابه در دو گونه aتعداد باندهای مشاهده شده در گونه اول وb تعداد باندهای مشاهده شده در گونه دوم‏.
ضریب تشابه از فرمول محاسبه می شود که در آن aتعداد باند‌های مشابه در دو گونه، b تعداد باندهای منحصر به گونه دوم‏.

ضریب رابطه یa+bنمونه هااز فرمول محاسبه می شود. که در آن d نشانگر تعداد باندهایی است که در گونه مورد مقایسه وجود ندارد (مقدم و همکاران، ۱۳۷۳)‏.
۲-۳-۵ استفاده از الکتروفورز در بررسی تنوع ژنتیکی
الکتروفورز پروتئین‌ها برای جمع‌آوری و ایجاد داده‌های سیستماتیک از ماکروملکول‌ها روشی است که بصورت وسیع مورد استفاده قرار می‌گیرد و به صورتی فزاینده در بین متخصصین سیستماتیک گیاهی محبوبیت یافته است (رحیمی نژاد، ۱۳۷۸)‏.
۲-۳-۵-۱ الکتروفورز پروتئین‌ها
تصور بر این است که این الگوها باید نمایشگر معیاری از تشابهات و اختلافات وراثتی در بین گیاهانی که بایکدیگر مقایسه می‌شوند باشند. استفاده از الگوهای پروتئینی در مطالعات سیستماتیک بر این پیش فرض مبنی است که پروتئین‌های افراد مختلف، جمعیت‌های مختلف، گونه‌های مختلف و غیره در صورت داشتن حرکت یکسان در داخل یک ژل مشابه‌اند و پس از رنگ‌آمیزی تولید باند‌هایی با عرض و شدت نسبتا یکسان می‌نمایند. هر یک از باندها به عنوان صفتی مجزا مورد بررسی قرار می‌گیرند و فرض بر این است که این صفات فرآورده‌های نسبتا مستقیم ژن می‌باشند. روش عمومی برای ارزیابی تشابهات پروتئین در میان جمعیت‌ها، اکسون‌ها و غیره بکار گرفتن نوعی معیار شباهت است (رحیمی‌نژاد، ۱۳۷۸)‏. شمارش ساده نسبت a/b که در آن a نشانگر تعداد باندهای مشترک وb تعدادکل باند‌های یافت شده در دو جمعیت، تاکسون و غیره است، روش مرسوم برای نشان دادن شباهت پروتئینی است. باید به این نکته اشاره کرد که این روش منجر به برآوردی از فاصله ژنتیکی نمی‌گردد (Sahai و Rana، ۱۹۷۷)‏. گاهی مخلوطی از عصاره‌های پروتئینی مربوط به دو تاکسون به منظور ارزیابی این که آیا باندها جدا می‌شوند یا مهاجرت شانه به شانه دارند با یکدیگر و بطور مخلوط در جریان قرار می‌گیرند. این روش ممکن است امکان ارزیابی خالص‌تر شانه به شانه را در مقایسه با در جریان قرار دادن عصاره‌های مجزا و به صورت بغل به بغل در یک قالب ژن فراهم آورد (رحیمی نژاد، ۱۳۷۸)‏. گسترده‌ترین تکنیک مورد استفاده برای آنالیز پروتئین‌های مخلوط SDS-PAGE (ژل الکتروفورز سدیم دودسیل سولفات پلی‌اکریل‌آمید) است. پروتئین‌ها براساس اندازه آنها جدا می‌شوند. با کمک آنالیزSDS-PAGE پروتئین‌های محلول در آب، باندهایی با غلظت متفاوت، وزن ملکولی و تحرک نسبی متفاوت گزارش شده‌اند (Shehata، ۲۰۰۴)‏.
از روشSDS-PAGE برای مقایسه الگوی پروتئین گلوبولین و آلبومین در واریته جو دو سر استفاده شد و به عنوان یک روش برای شناسایی واریته‌های جو دو سر عنوان گردید (Dvoracek و همکاران، ۲۰۰۳)‏.
۲-۳-۶ مدل‌های آماری برآورد تنوع
اختلاف در دامنه تظاهر صفات مورفولوژیک و فیزیولوژیک در نتیجه تنوع ژنتیکی است. تجزیه و تحلیل‌های چند متغیره به عنوان ابزار کارایی در برآورد تنوع ژنتیکی، تعیین سهم هر صفت از تنوع کل، طبقه‌بندی جوامع بیولوژیک و شناخت فاکتورهای موثر در تنوع ژنتیکی به کار می‌رود. (Batrual و همکاران، ۱۹۸۵)‏.
تجزیه خوشه‌ای: تجزیه کلاستر یکی از روشهای آماری چند متغیره و غیر پارامتری است. هدف از این نوع تجزیه آن است که افراد یک جامعه یا نمونه حاصل از افراد یک جامعه را براساس اطلاعات p صفت در داخل گروه‌های مختلف قرار بدهیم. بطوری که افراد هم گروه از لحاظ p صفت مورد نظر بسیار به هم شبیه و افراد در گروه‌های متفاوت از لحاظ این صفات تفاوت بیشتری داشته باشند. برای سنجش تشابه یا تفاوت افراد باید معیارهای تشابه و معیار عدم تشابه یا فاصله تعریف شود. پس از تعیین معیار تشابه یا عدم تشابه باید مکانیسمی تعریف شود که نحوه تشکیل گروه‌هایی از افراد تشابه را نشان دهد. بنابراین تجزیه کلاستر شامل دو مرحله است شامل:
۱. محاسبه کمیت تشابه یا عدم تشابه بین افراد
۲. گروه‌بندی افراد براساس کمیت‌های بندیک
معمول‌ترین معیارهای نوع اول از نوع معیارهای فاصله یا عدم تشابه هستند که بر اساس صفات کمی افراد محاسبه می‌شود در صورتیکه خصوصیات کیفی افراد یک جامعه مدنظر باشند، معمولا از معیارهای تشابه استفاده می‌شود. برای شرایطی که صفات مورد بررسی تلفیقی از کمی یا کیفی باشند می‌توان از معیارهای تشابه یا عدم تشابه استفاده نمود (Johanson و Wichern، ۱۹۸۸)‏. روشهای زیادی در انجام تجزیه کلاستر وجود دارد، اما این کار عمدتا به دو روش طبقاتی و غیرطبقاتی صورت می‌گیرد. روش طبقاتی نیز خود به دو صورت طبقاتی تجمعی و طبقات تقسیم کننده انجام می‌شود (Romesburg، ۱۹۹۰)‏. روش طبقاتی با محاسبه فاصله هر فرد از سایر افراد شروع می‌شود. در روش تجمعی هر فرد در ابتدا یک گروه مجزا را تشکیل می‌دهد، سپس گروه نزدیک به هم بتدریج ترکیب شده تا در نهایت کلیه افراد در یک گروه قرار گیرند (Jolliffe، ۱۹۸۶)‏.
انجام تجزیه کلاستر شامل مراحل زیراست:
۱. تشکیل ماتریس داده‌ها
۲. استاندارد کردن ماتریس داده‌ها
۳. محاسبه ماتریس فاصله یا عدم تشابه در اعمال روشهای کلاستر
۴. مرتب کردن مجدد ماتریس داده‌ها
۵. در صورت لزوم محاسبه ضریب همبستگی کوفتیک (Romesburg، ۱۹۹۰)‏.
در مرحله تشکیل ماتریس داده‌ها باید داده را برای n فرد درp متغیراندازه‌گیری شده مرتب نمود در این ماتریس ستونها معرف افراد و ردیفها عبارتند از متغیرها مورد بررسی خواهند بود و سپس داده‌ها استاندارد می‌شود. لازم به توضیح است که این مرحله الزامی نیست و اگر واحد متغیرهای اندازه‌گیری با یکدیگر متناسب باشند و یا اینکه واریانس بین داده‌ها زیاد نباشد می‌توان داده‌ها را استاندارد نکرد، استاندارد کردن باعث می‌شود تا داده‌ها بدون واحد شوند و مقایسه بین تمامی داده‌ها امکان‌پذیر گردد. برای استاندارد کردن داده‌ها چندین روش وجود دارد (مقدم و همکاران، ۱۳۷۳)‏.
۲-۳-۶-۱ تجزیه به مولفه‌های اصلی
تکنیک تجزیه به مولفه‌های اصلی برای اولین بار توسط (Pearson، ۱۹۰۱)‏.شرح داده شد. وی معتقد بود که این روش راه حل مناسبی برای برخی از مسائل مورد توجه دانشمندان بیومتری می‌باشد. باوجود این پیرسون یک روش عملی برای محاسبه بیش از ۲یا۳ متغیر ارائه ننمود. روشهای محاسباتی عملی سالها بعد توسط (Hotelling، ۱۹۳۳)‏. توضیع داده شد. چون در آن زمان محاسبات بادست انجام می‌شد، انجام محاسبات برای بیش از چند متغیر بسیار مشکل بود (Jolliffe، ۱۹۸۶؛ Wichern، ۱۹۸۸)‏. ولی بعد از استفاده از کامپیوتر درسطع وسیع، این تکنیک نیز در سطح گسترده‌ای مورد استفاده واقع شد. هدف از این تجزیه یکی توصیف جامعه بر اساس اطلاعات کلی جامعه یا نمونه‌ای ازجامعه روی p صفت است و دیگر کاهش حجم داده‌ها برای استفاده‌های عددی می‌باشد (مقدم و همکاران، ۱۳۷۳)‏. به هنگام تجزیه به مولفه‌های اصلی اغلب این امید وجود دارد که واریانس‌های بسیاری از مولفه‌ها آن قدر کم باشد که قابل صرف ‌نظر باشند. در این حالت، تغییرات درمجموعه داده‌ها می‌تواند به طور کافی بوسیله تعداد کمی از شاخص‌های z که دارای بیشترین واریانس هستند، توضیح داده شوند. در این حالت کارایی تجزیه بالا می‌رود، زیرا تغییرات درp متغیر اولیه x بوسیله تعدادکمی متغیر z بیان می‌شود. لازم به ذکر است که تجزیه به مولفه‌های اصلی همواره نمی‌تواند تعداد زیادی از متغیرهای اولیه را به تعداد کمتری از شاخص‌ها تغییردهد. در واقع اگر متغیرهای اولیه همبستگی نداشته باشند، این تجزیه بی‌ارزش خواهد بود. بهترین نتیجه زمانی عاید می‌شود که متغیرهای اولیه همبستگی بسیار شدید مثبت و یا منفی داشته باشند. اگر چنین حالتی وجود داشته باشد نمایش ۲۰ یا ۳۰ متغیر اولیه بوسیله ۲یا۳ مولفه اصلی به نحو مطلوبی امکان‌پذیر خواهد شد. اگر این حالت مطلوب رخ دهد، مولفه‌های اصلی مهم می‌توانند به عنوان معیارهایی جهت نشان دادن جنبه‌های متفاوتی از داده‌های جالب توجه باشند. دانستن این موضوع نیز حائز ارزش خواهد بود که امکان کاهش تعداد متغیرهای اولیه وجود دارد و بسیاری از آنها موارد مشابهی را اندازه می‌گیرد (مقدم و همکاران، ۱۳۷۳)‏.

فصل سوم:
مواد و روش ها

۳-۱ مشخصات اقلیمی و زراعی منطقه اجرای طرح
ایستگاه تحقیقات مراتع همندآبسرد در ۷۰ کیلومتری شرق تهران، در مسیر جاده تهران و فیروزکوه و ۱۵ کیلومتری جنوب شرقی شهرستان دماوند واقع شده است. طول و عرض جغرافیایی آن به ترتیب ً۲۵ ۱۵ ْ۵۲ درجه شرقی و ً۹ ۴ ۳۵ درجه شمالی و ارتفاع آن از سطح دریا ۱۹۶۰ متر می باشد. این منطقه در دامنه جنوبی رشته کوه البرز با شیب ملایم واقع شده است.در این بررسی، از آماراقلیمی ایستگاه استفاده گردیده که اغلب بارش آن به صورت برف در طول ماههای آذر، دی، بهمن و اسفند است (جدول۱). از نظر اقلیمی ایستگاه همند جزء منطقه نیمه استپی سرد (Sub steppic) بوده و دارای تابستان کوتاه و معتدل و زمستانی سرد می باشد(جدول۲).خاک ایستگاه جزء خاکهای قهوه ای و دارای مقدار زیادی آهک در عمق ۱۰۰-۸۰ سانتیمتری می باشد. اسیدیته آن برابر ۷/۷ بوده که از نظر مواد آلی فقیر و بافت آن نیمه سنگین (Clay loam) است.
۳-۲ مواد گیاهی مورد آزمایش
بذر ۲۳ ژنوتیپ علف گندمی بلند (Agropyrone elongatum) از بانک ژن منابع طبیعی موسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور تهیه

Leave a Comment