کرده باشد. کشت کرپه در پاییز موجب میشود تا بذر جوانه نزده تا اوایل بهار در خاک سالم باقی بماند این گیاه را میتوان به طریق دست پاش و یا ردیفی کشت نمود، جهت تولید علوفه خشک و احداث چراگاه باید از بذرپاشی یا ردیف کاری با فاصله خطوط نزدیک استفاده شود. عمق بذر در خاک نباید از ۱ تا ۲ سانتیمتر بیشتر باشد در خاکهای سنگین معمولاً در عمق یک سانتیمتری و در خاکهای سبکی کمی عمیقتر بین ۱ تا ۵/۲ سانتیمتر کاشته میشود. جهت تولید بذر باید این گیاه را در خطوط دور از یکدیگر (۶۰ تا ۱۰۰ سانتیمتر) کشت نمود (کریمی، ۱۳۶۹).

۲-۳ الکتروفورز
۲-۳-۱ تاریخچه استفاده از الکتروفورز
اصول روش استفاده از الکتروفورز از اواخر قرن ۱۹شناخته شده و برای اولین بار در سال ۱۹۳۷ توسط Tezilios در سوئد بکار گرفته شد.او روش نوار متحرک را برای تجزیه به پروتئین‌های سرم در محلول ابداع نمود و توانست با دستگاه خود پنج ناحیه تفکیک را در محیط مایع شناسایی کند.عیب مطالعه پروتئین‌ها در محیط مایع این بود که پس از قطع جریان برق، پروتئین‌ها انتشار یافته و پراکنده می‌شدند و قدرت تفکیک مطالعه پروتئین‌ها در محیط مایع این بود که پس از قطع جریان برق، پروتئین‌ها انتشار یافته و پراکنده می‌شدند و قدرت تفکیک آنها بسیار پایین بود.درسال ۱۹۴۸ژل آگارز معرفی شد که به طور عمده برای تفکیک اسیدهای نوکلئیک به کار می‌رود‏.روش الکتروفورز ژل نشاسته در سال ۱۹۵۵معرفی شد که در آن از یک بافر با قدرت یونی کم استفاده می‌شود و برای شناسایی ایزوانزیم‌ها به کار می‌رود. ژل پلی‌اکریل‌آمید برای جداسازی پروتئین‌ها در سال ۱۹۵۹معرفی گردید (Sahai و Rana، ۱۹۷۷)‏.
۲-۳-۲ اصول الکتروفورز
اصطلاح الکتروفورز از زبان یونانی گرفته شده است و مفهوم آن انتقال مواد باردار در یک میدان الکتریکی می‌باشد (Obsome، ۱۹۷۰)‏. پروتئین‌ها مواد بارداری هستند که اگر عصاره خام یا پالایش شده پروتئین یک بافت گیاهی یا جانوری را روی یکی از محیط‌های مناسب نظیر ژل اکریل‌آمید قرار داده و میدان الکتریکی برقرار سازیم بر حسب بار الکتریکی، وزن ملکولی و یا شکل فضایی خود به طرف آند یا کاتد حرکت می‌کنند و از همدیگر جدا می‌شوند. فاکتور مهم و موثر در حرکت پروتئین‌ها مربوط به بار خالص آنهاست. هر چه نسبت بار به حجم بیشتر باشد ملکول‌ها سریع‌تر حرکت می‌کنند، علاوه بر این اندازه ملکول نیز در تحرک الکتروفورز نقش دارد تا آنجا که ملکول‌های بزرگ پروتئینی ممکن است قادر به عبور از منافذ ژل نبوده و حرکت آنها متوقف شود (Hames و Rickwood، ۱۹۸۱) درطی الکتروفورز کاتیون‌ها (بار+) به طرف کاتد (بار-) وآنیون‌ها (بار-) به طرف‌آند (بار+) حرکت می‌نمایند. محیط حرکتی کاتیون‌ها و آنیون‌ها ژلی است که در ارتباط با بافر می‌باشد. بافر برای نگهداری موقعیت یونیزه ملکول‌ها در نمونه می‌باشد، زیرا تغییر اندک درPH ممکن است بار ملکولی را تغییر دهد و جریان الکتریکی نیز در طی الکتروفورز باید ثابت باشد. در طی الکترولیز یون‌هایOH- و H2در کاتد وO2 وH+ در آند تولید می‌شوند. یون‌های هیدروکسیل با تفکیک اسید ضعیف بافر (HA) باعث تشکیل بیشتر آنیون (A-) می‌شوند. در آند، آنیون‌ها با یون H+ ترکیب شده و مجددا (HA) تشکیل می‌گردد و الکترون‌های حاصله باعث برقراری جریان می‌شوند. بافر الکترود، برای نگهداری ملکول‌ها به شکل یونیزه شده نیز لازم است پس از اتمام الکتروفورز، پروتئین‌ها یا آنزیم‌های تفکیک شده بدون آن که پراکنده شوند در محیط جامد می‌مانند. می‌توان آنها را مورد رنگ آمیزی قرار داد (Andrews، ۱۹۸۶)‏. درتفسیر تفاوتهای موجود در ضخامت و شدت نوارهای الکتروفورزی هرگیاهک بایستی دقت خاصی اعمال گردد. زیرا تفاوتهای مذکور می‌تواند ناشی از تفاوت در نسبت وزن به حجم و یا تمرکز پروتئین به خاطر اثرات خرد محیطی در خلال تشکیل گیاهک باشد (مصطفایی، ۱۳۸۲)‏.
۲-۳-۳ انواع الکتروفورز
انواع الکتروفورز مورد استفاده در تحقیقات بر حسب نوع بستر آن عبارتنداز:
* الکتروفورز کاغذی: این نوع الکتروفورز از اولین روش‌هایی می‌باشد که برای الکتروفورز ناحیه‌ای ابداع گردیده است. درابتدا استفاده اصلی آن در جداسازی اجزاء مختلف پروتئین‌های سرم در امور پزشکی بود. کاغذ قدرت وضوح سایر بسترها را ندارد و به علت تیرگی نمی‌توان از آن برای سنجش‌های کمی استفاده نمود. زمان الکتروفورز نیز طولانی است، به علاوه جذب پروتئین‌ها بر روی کاغذ باعث اثرات دنباله‌ای در الگوی باندی می‌شود (عبد میشانی، ۱۳۷۷)‏.
* الکتروفورز ژل آگارز: آگار پلی‌ساکاریدی است که از جلبک تهیه می‌شود. ژل‌های آگار غلظت‌هایی در حدود۷۵/۰درصد دارند. ژل آگارز ارزان قیمت بوده، نگهداری وتهیه آن آسانتر است بر خلاف کاغذ، استات سلولز وژل نشاسته دارای شفافیت می‌باشد. بطوریکه امکان اندازه‌گیری دانسیومتریک را فراهم می‌سازد. الکتروفورز ژل آگار دارای سرعت زیادی بوده (۳۰-۲۵ دقیقه) وبرای نخستین بار در مطالعات ایزوزایمی برای مطالعه لاکتات دهیدروژناز وسوربیتول دهیدروژناز به کار گرفته شد (عبدمیشانی، ۱۳۷۷)‏.
* الکتروفورز استات سلولز: منحنی‌های استات سلولز مزایای زیادی نسبت به کاغذ دارند، سرعت این روش الکتروفورز بیشتر بوده و وضوح آن به گونه‌ای است که می‌توان باندها را مورد سنجش کمی قرار داد. در این نوع الکتروفورز مشکلات اثرات دنباله‌ای که در الکتروفورز کاغذی دیده می‌شود وجود ندارد (عبدمیشانی، ۱۳۷۷)‏.
* الکتروفورز ژل نشاسته: ژل نشاسته بهترین بستر برای مطالعه ایزوزایم است. قدرت وضوح این ژل بیشتر از سایر بسترها، همچنین اکریل‌آمید است. از معایب ژل نشاسته این است که بدون انجام فرایندهای خاص، ژل غیر قابل رویت است، بنابراین مطالعات مستقیم دانسیتومتریک را مشکل تر می‌سازد. ژل نشاسته به راحتی قابل حمل با دست نبود وزمان لازم برای الکتروفورزآن نسبت به سایر روش‌ها طولانی‌تر است (عبد میشانی، ۱۳۷۷)‏.
الکتروفورز ژل‌اکریل‌آمید: ژل پلی اکریل‌آمید یک پلیمر بی‌بار و غیر فعال (از نظر شیمیایی) است که ظاهری شفاف دارد و در محدوده وسیعی از pH، درجه حرارت و شرایط بافری پایدار است. این ژل از ترکیب اکریل‌آ‌مید و یک ماده رابط که معمولا n,nًٌ متیلن بیس‌اکریل‌آمید (به اختصار بیس) است، شکل می‌گیرد. بدین صورت که ملکول‌های اکریل‌آمید بصورت طولی به هم متصل می‌شوند و ماده رابط نیز مسئول تولید پل‌های عرضی متعدد بین ‌رشته های اکریل‌آمید است. نتیجه این واکنش تشکیل شبکه‌ای است که در آن طول رشته‌های اصلی وابسته به غلظت نسبی اکریل آمید و تراکم اتصالات عرضی وابسته به غلظت بیس اکریل‌آمید است. پلیمریزاسیون اکریل‌آمید یک واکنش رادیکالی است که توسط پراکسید یا انرژی فتوشیمیایی شروع می‌شود. معمول‌ترین روش انجام این واکنش، روش شیمیایی است. در این روش پرسولفات آمونیوم به عنوان شروع کننده وTemed به عنوان کاتالیزور عمل می‌کنند. در مواردی که پروتئین‌ها به پرسولفات و یا محصولات جانبی پلیمریزاسیون حساس هستند یا قدرت یونی ژن باید بسیار پایین باشد، واکنش فتوشیمیایی مناسب‌تر است. اکسیژن هوا در پلیمریزاسیون اکریل‌آمید اثر مهاری دارد. بدین خاطر نمی‌توان ژل پلی‌اکریل‌آمید را همچون ژل‌آگارز روی سطوح شیشه‌ای سر باز تهیه کرد. تخلیه هوای محلول‌ها قبل از افزودن کاتالیزورها نیز به همین دلیل است. دمای مناسب واکنش پلیمریزاسیون ۳۰-۲۵ درجه سانتیگراد است. پلیمریزاسیون در دماهای بالاتر از ۵۰ درجه سانتیگراد، اگر چه سریع‌تر صورت می‌گیرد ولی به تولید رشته‌های کوتاه اکریل‌آمید و ژل فاقد خاصیت الاستیکی می‌انجامد. برای طولانی کردن زمان پلیمریزاسیون می‌توان محلول را خنک کرد و سپس به هم افزود. به طور معمول سرعت پلیمریزاسیون باید به حدی باشد که زمان انعقاد ژل ۶۰-۲۰ دقیقه طول بکشد. خصوصیاتی فیزیکی ژل پلی‌اکریل‌آمید از قبیل اندازه منافذ، خاصیت الاستیکی، چگالی ژل و قوام مکانیکی متاثراز غلظت دو جزءتشکیل دهنده آن است. غلظت این دو اجزاء در ژل پلی‌اکریل‌آمید با دو فاکتور درصد TودرصدC نشان داده می‌شود درصد حجمی/وزنی هردو ماده اکریل‌آمید وبیس را نشان میدهد.

درصد c درصد وزنی بیس (ماده رابط) نسبت به هر دومونومر را نشان می‌دهد.

تفاوت انواع ژل‌هایی که از یک محلول استوک اکریل‌آمید و بیس اکریل‌آمید ساخته می‌شوند، تنها باt % بیان می‌شود. زیرا با رقیق کردن محلول استوک c% ثابت می‌ماند و فقط t% تغییر می‌کند. با ثابت ماندن c% هر چه %tکاهش یابد اندازه منافذ ژل بزرگتر می‌شود. با این حال ژل‌هایی با t کمتر از ۵/۲% به دلیل قوام میکانیکی قابل استفاده نیستند. بنابراین اندازه منافذ ژل پلی‌اکریل‌آمید از حدود. nm80 بزرگتر نمی‌شوند. اگر %tثابت در نظر بگیریم، افزایش C% (از طریق تهیه محلول استوک با %C متفاوت) منجر به کاهش اندازه منافذ ژل می‌گردد. اگر C% بیش از حد افزایش یابد، اثر معکوس داشته، به دلیل تشکیل ساختار‌های شبه دانه‌ای، به بزرگتر شدن اندازه منافذ منتهی می‌گردد (Dunn، ۲۰۰۱؛Westermeier، ۱۹۹۶؛Walker، ۱۹۹۳)‏.
۲-۳-۴ اطلاعاتی در مورد مکانیسم کار با الکتروفورز
انواع سیستم بافری: هر نوع الکتروفورز متشکل از یک محلول مورد استفاده برای تهیه ژل و یک یا دو محلول الکترودی است. اگر محلول ژل و محلول‌های الکترودی از یک ماده تشکیل شده باشد سیستم بافری را سیستم بافری پیوسته گویند و اگر این مواد مشابه و یکسان نباشند سیستم بافری راسیستم بافری ناپیوسته گویند. در سیستم بافری پیوسته یون‌های بافری و pH مشابهی در نمونه تهیه شده بافرالکترود و ژل وجود داشت و نمونه‌ها به طور مستقیم روی ژل جدا کننده بارگیری می‌شوند. در سیستم ناپیوسته، یک ژل توده کننده یا متمرکز کننده با ترکیب بافری و pH متفاوت وجود دارد که عصاره‌ها به این ژل تزریق می‌شوند. این ژل نمونه‌های تزریق شده را در یک نوار باریک، متمرکز کرده و مانع از انتشار آنها می‌شود اما جدایی پروتئین‌ها روی ژل جدا کننده که منافذ کوچکتری از ژل توده کننده دارد انجام می‌شود (Andrews، ۱۹۸۶)‏.
مکانیسم عمل تثبیت کننده: قبل از رنگ‌آمیزی ژل لازم است پروتئین‌ها، تثبیت شوند تثبیت پروتئین دو نقش دارد: ۱) پروتئین‌ها را در ژل ثابت نگه داشته و انتشار آنها را در ژل به تاخیر می‌اندازد. ۲) موادی که ممکن است با مراحل رنگ‌آمیزی تداخل کند مثل پاک کننده‌ها، گلیسین و…را حذف می‌کند. تثبیت کننده‌هایی که معمولا مورد استفاده قرار می‌گیرند عبارتند از: گلوترالدئید، اتانول، متانول، اسید استیک و تری کلرواستیک اسید (T.C.A) (Dunn، ۱۹۹۳)‏.
رنگ کردن: پس از تثبیت، رنگ‌آمیزی ژل اکریل‌آمید با کوماسی‌بلو انجام می‌شود. رنگ‌آمیزی با این ماده آسان بوده و قادر است باندهای بسیار کوچک را آشکار نماید. لازم به ذکر اس

Leave a Comment