SDS و ماده احیاء کننده، کاملا واسرشت می‌شوند. حرارت، جدا شدن زیر واحدهای پروتئین‌های چند واحدی و اشباع شدن زنجیره‌های پلی پپتید با SDSرا تسهیل می‌کند (مصطفایی، ۱۳۸۲)‏. نمونه‌ها بعد از خنک شدن داخل فریزر قرار می‌گیرند. حال نمونه‌ها آماده برای روی ژل بردن هستند.
۳-۴-۲ الکتروفورز پروتئین‌ها
مشخص شده که تنوع پروتئین‌ها کل توسط تغییرات در SDS-PAGE برای شناسایی ژنوتیپ‌های مختلف بکار می‌رود و گسترده‌ترین تکنیک مورد استفاده برای آنالیز پروتئین‌های مخلوط SDS-PAGE است که پروتئین‌ها بر اساس اندازه آنها جدا می‌شوند (Shehata، ۲۰۰۴)‏.
در این تحقیق برای الکتروفورز پروتئین از روش SDS-PAGE با اندکی تغییر استفاده شده است‏.
الف: مواد مورد نیاز:
۱- اکریل‌آمید
۲- پرسولفات آمونیوم
۳- N و N متیلن بیس‌اکریل‌آمید یا بیس‌اکریل‌آمید
۴- تمد (TEMED) Tetramethyl ethylenediaminel -N,N N,N
۵- سدیم دو دسیل سولفات ((SDS) Sodium dodecyl sulpate)
۶- تریس (هیدروکسی متیل‌آمینومتان)
۷- اسیدکلریدریک
۸- گلایسین
۹- مرکاپتوآتانول
۱۰- بروموفنل (Bromophenol bluo)
۱۱- گلیسرول
۱۲- آب مقطر دوبار تقطیر شده فاقد یون
۱۳- اسید استیک گلایسیال
۱۴- کوماسی بریلیانت بلو ۲۵۰ -R (Coomasie brili nane blue)
۱۵- آگار یا آگارز
۱۶- کیت پروتئین استاندارد (pharmacia)
۱۷- ایزوبوتانول اشباع شده از آب
۱۸- متانول
۱۹- تری کلرواستیک اسید
۲۰- اتانول
۲۱- وازلین
ب: وسایل لازم
۱- تانک الکتروفورز و متعلقات آن
۲- سرنگ هامیلتون
۳- سمپلر و سر‌سمپلر
۴- پمپ خلاء
۵- میله مغناطیسی و دستگاه چرخاننده آن
۶- کاغذ صافی واتمن
۷- دستگاه pH متر
۸- گرم کننده الکتریکی
۹- اپندرف‌های ۵/۱و۲ میلی لیتری
ج: محلول‌ها
۱- محلول استوک اکریل‌آمید (۸/۳۰ درصد)‏. g30 اکریل‌آمید و g8/0 بیس‌اکریل‌آمید را در زیر هود وزن کرده و در آب مقطر تا حجم نهایی ml100حل شد. محلول را با کاغذ واتمن شماره۱ صاف کرده و در ظرف تیره ریخته شد. این محلول تا ۳ ماه در یخچال قابل نگهداری است.
توجه: از استنشاق پودر اکریل‌آمید و بیس‌اکریل‌آمید در هنگام توزین و تماس با محلول آنها باید خودداری کرد. توزین این مواد باید در زیر هود صورت گیرد و در هنگام تهیه محلو‌ل‌ها و کار با آنها دستکش پوشید.
۲- بافر ژل پایین، g2/18 تریس و g4/0 SDS را در حدود ml50 آب مقطر حل کرده pH با اسید کلریدریک ۲ مولار به۸/۸ رسانده و سپس آب مقطر تا حجم نهایml 100 اضافه شد. غلظت تریس در این بافر ۵/۱ مولاراست (هنگام تهیه ژل یک حجم آن با سه حجم از بقیه اجزای ژل مخلوط می‌شود) این بافر تا چندین ماه در یخچال قابل استفاده است.
۳- بافر ژل بالا، g1/6 تریس و g4/0SDS را در حدود ml50 آب مقطر حل کرده با اسید کلریدریک ۲مولارpH آن را به۸/۶ رسانده شد سپس آب مقطر تا حجم نهایی ml100 اضافه شد. غلظت تریس در این بافر ۵/۰ مولار است (این بافر تا چندین ماه در یخچال قابل استفاده است)‏.
۴- بافر الکترود (بافر مخازن)‏. g 3 تریس ، g 4/14 گلیسین و g1SDS را در یک لیتر آب مقطر حل کرده که pH این بافر حدود ۳/۸ است (نیاز به تنظیم ندارد)‏.
۵- پرسولفات آمونیوم ۱۰ درصد، g1/0 پرسولفات آمونیوم در ml 10 آب مقطر حل شد (این محلول بایستی تازه باشد)‏.
۶- محلول رنگ‌آمیزی باکوماسی بریلیانت‌بلو: (۲۵۰-Coomassie brilliane blue R) کوماسی بریلیانت بلو ۱/۰درصد، اسیداستیک گلاسیال ۱۰ درصد، متانول ۴۰ درصد‏.
۷- محلول رنگ‌بر: اسید استیک گلاسیال ۱۰ درصد، متانول ۴۰ درصد،
۸- ml50 اسیداستیک و ml200متانول را با یکدیگر مخلوط نموده سپس حجم آن با آب مقطر به ml500 رسانده شد. این محلول در دمای آزمایشگاه قابل نگهداری است.
د: طرز تهیه ژل صفحه‌ای عمودی
۱- صفحات شیشه‌ای را کاملا تمیز کرده فاصله اندازه‌ها را با توجه به ضخامت مورد نیاز
ژل انتخاب شد. و بین صفحات شیشه‌ای قرار داده شد. قالب شیشه‌ای را با چند گیره محکم کرده، بخاطر احتمال نشت محلول ژل از حد فاصل شیشه‌ها و فاصله اندازه‌ها، با استفاده از وازلین شیشه‌ها را از بیرون کاملا آب‌بندی می‌نماییم تا محلول خارج نشود و با آب مقطر بررسی می‌کنیم‏.
۲- محلول ژل پایین (ژل جدا کننده)، مواد مورد استفاده در ژل پایین شامل بافر ژل پایین، محلول استوک اکریل‌آمید، پرسولفات‌آمونیم وTEMED می‌باشد. مقدار مورد نیاز از هر یک را برداشته با هم مخلوط می‌کنیم البته بجز تمد که آخرین مواد ماست که به محلول اضافه می‌کنیم و پس از هم زدن به سرعت و دقت در قالب شیشه‌ای تا ارتفاع مناسب ریخته، بطوری که ۳ سانتیمتر فضا برای ژل بالا باقی بماند. انعقاد ژل پایین معمولا ۴۵-۱۵ دقیقه طول می‌کشد. بعد از انعقاد ژل پایین نوبت به ژل بالا می‌رسد.
۳- محلول ژل بالا (ژل متراکم کننده)، مواد مورد استفاده در ژل بالا شامل بافر ژل بالا، محلول استوک اکریل‌آمید، پرسولفات آمونیم ۱۰ درصد و TEMED می‌باشد. اجزای ژل بالا غیر از تمد در ظرف مناسبی مخلوط شده و خوب هم می‌زنیم در آخر تمد را اضافه می‌کنیم و پس از هم زدن سریعا تا ارتفاع مناسب روی ژل پایین ریخته، سپس شانه را در ژل بالا فرو برده بطوریکه دندانه‌های آن حدود ۵/۱ cm ازسطح ژل پایین فاصله داشته باشد. ژل بالا معمولا در کمتر از ۱۵ دقیقه منعقد می‌شود (کناره دندانه‌های شانه از ژل منعقد شده قابل تشخیص است)‏.
۴- شانه و فاصله ‌انداز پایین را از حد فاصل شیشه‌ها خارج کرده هر گونه ژل اضافی یا محلول منعقد نشده درون چاهک یا انتهای ژل را با تزریق بافر الکترود خارج کرده و قالب شیشه‌ای را به تانک الکتروفورز متصل نموده، مخازن تا ارتفاع مناسب با بافر الکترود پر شد اگر موقعیت چاهک‌ها مشخص نباشد، ممکن است نمونه‌گذاری به طور صحیح صورت نگیرد یا ته چاهک‌ها در اثر فرورفتن نوک وسیله نمونه‌گذاری دچار آسیب گردد. راه دیگر تشخیص چاهک‌ها، افزودن یک قطره محلول بروموفنل بلو به محلول ژل بالا در هنگام تهیه آن است. در این حالت ژل بالا به رنگ آبی روشن در می‌آید. هر گونه حباب هوا در انتهای ژل با تزریق بافر توسط سرنگ خارج می گردد.
۵- از نمونه‌های پروتئین آماده شده با کمک سمپلر به میزان مناسب با غلظت پروتئین یکسان به دقت در چاهک‌ها ریخته شد. به دلیل وجود گلیسرول، نمونه در ته چاهک قرار می‌گیرد. مقدار پروتئین لازم در هر چاهک بستگی به میزان خلوص نمونه و روش رنگ آمیزی دارد.
۶- کابل‌ها را به الکترودهای مربوطه وصل نموده، برای الکتروفورز در جریان الکتریکی ثابت، شدت جریان ۳۰-۲۰ میلی آمپر مناسب است. در این حالت رنگ نشانگر (برموفنل بلو) در عرض ۵/۲-۵/۱ انتهای ژل می‌رسد. به علت اینکه احتمال حرکت معادل یا سریع‌تر بعضی از اجزای نمونه نسبت به رنگ نشانگر وجود داشت، جریان برق را قبل از رسیدن رنگ نشانگر به انتهای ژل قطع گردید.
۷- بعد از قطع جریان، قالب شیشه‌ای را از تانک جدا کرده و آن را در کف دست قرار داده و با فرو بردن یک فاصله اندازه به حد فاصل شیشه‌ها و حرکت آرام آن، شیشه بالا را برداشته، ژل بالا را با لبه یکی از فاصله اندازه‌ها قطع کرده و دور ریخته شد. و ژل پایین را نگاه می‌داریم‏.
۳-۵ نکات:
۱- برای قرار دادن قالب شیشه‌ای در تانک الکتروفورز عمودی همچون تانک‌های ساخت داخل، بهتر است ابتدا مخزن پایین را تا ارتفاع مناسب از بافر پرکرده سپس قالب شیشه‌ای رابه طور مایل از یک گوشه به آرامی وارد بافر نمایید. در این حالت حبابی در انتهای ژل وارد نمی‌شود‏.درصورت ورود حباب هوا به انتهای ژل، قالب را خارج نموده با بافر الکترود یا آب مقطر حباب‌های ته ژل را خارج کنید سپس عمل بالا را تکرار کنید.
۲- درصورتی که پروتئین در ژل بالا یا ابتدای ژل پایین مانده باشد، بهتر است ژل بالا جدا نشود و همراه بقیه ژل رنگ‌آمیزی شود.
۳-۵-۱ رنگ‌آمیزی پروتئین‌ها و رنگ زدایی ژل
الف: روش رنگ‌آمیزی با آبی‌کوماسی
بعد از جدا کردن ژل از شیشه، ژل را داخل فیکساتور قرار می‌دهیم به مدت نیم ساعت روی شیکر باشد. بعد ژل را خارج کرده با آب مقطر می‌شوییم و داخل ظرف شیشه‌ای یا پلاستیکی درب‌دار قرار می‌دهیم روی آن مقدار کافی از محلول رنگ‌آمیزی (ml 100) بر روی آن اضافه می‌کنیم‏.درب ظرف را بسته به مدت یک ساعت داخل آون قرار می‌دهیم و یا چند ساعت آن را روی شیکر قرار می‌دهیم. این مدت برای رنگ‌آمیزی ژل کافی است.
ب: رنگ بری ژل
پس از تخلیه محلول رنگ، ژل با آب مقطر کاملاً شستشو یافت و محلول رنگ برI به اندازه ۱۰۰ml برروی ژل اضافه شد سپس ظرف درب دار روی شیکر با حرکت آرام به مدت یک ساعت قرار داده شد آن وقت ژل را از رنگبر I بیرون آورده و مجدداً با آب مقطر شسته و آن را درون محلول رنگبر II که رقیق تر قرار می‌دهیم و به مدت یک ساعت روی شیکر با حرکت آرام قرار داده و ژل به مدت یک شب درون رنگبر II می‌ماند پس از تیره شدن محلول رنگبر II،آن با محلول تازه جایگزین می‌گردد و این عمل چندین بارتکرار یافت تا زمینه ژل پس از چند روز شفاف گردید و باندهای پروتئینی به وضوح دیده شدند.
ج: نگهداری ژل
ژل‌ها پس از رنگ‌بری مناسب در اسیداستیک ۳ درصد در دمای آزمایشگاه نگهداری شدند. این ژل‌ها آماده عکس‌ برداری و تفسیر بودند که در فصل چهارم نتایج خواهد آمد.
۳-۵-۲ طرزتهیه مارکر
مارکر مورد استفاده حاوی Tetramer Albumin Bovine(وزن مولکولی ۲۷۲ کیلو دالتون)، Dimer Albumin Bovineh(وزن مولکولی ۱۳۲ کیلو دالتون)، Albumin Egg(وزن مولکولی ۴۵ کیلو دالتون)، Carbonic Anhydrase(وزن مولکولی ۲۹ کیلو دالتون) بود.
همگی باهم مخلوط گردیدند و محلول بدست آمده را با همان مقدار بیس بافر مخلوط کردیم. و به مدت ۳ دقیقه در حال جوش در دمای oC 110 در بن‌ماری قرار دادیم و بعد از مدتی که هم دما با محیط شدند قابل لود کردن در چاهک می‌باشد که به میزان ۳۰ میکرولیتر لود گردید. استانداردهای وزنی و نمونه‌های مورد مطالعه را در شرایط یکسان الکتروفورز کرده و پس از اتمام SDS-PAGEژل را رنگ‌آمیزی نمودیم.
د: تعیین وزن ملکولی پروتئین‌های مجهول
سدیم‌ دودسیل‌ سولفات درحضور ماده احیاء کننده و حرارت به سراسر زنجیره‌های پلی‌پپتیدی وصل می‌شود. مقدار SDS که به هر زنجیره پلی‌پپتیدی متصل می‌گردد، متناسب با وزن ملکولی (mw) پلی‌پپتید است. مجموعه‌های پلی پپتیدی SDS حاصله که تراکم بار الکتریکی مشابهی دارند در ژل پلی‌اکریل‌آمید بر اساس وزن ملکولی خود حرکت می‌کنند. تحت چنین شرایطی مسافت نسبی طی شده توسط پروتئین‌ها با لگاریتم وزن ملکولی آنها رابطه خطی دارد. بنابراین اگر چند پروتئین شناخته شده به عنوان استانداردهای وزنی در دسترس باشد می‌توان وزن ملکولی پروتئین‌های مورد مطالعه را بر اساس آنها تخمین زد.
۳-۶ روش

Leave a Comment